(4) 克隆形成完成后，使用1 mL 4%多聚甲醛进行细胞固定，固定时间为15-30分钟。最后，用PBS洗涤；

(5) 向每个孔中加入1 mL结晶紫染液，染色时间控制在10-20分钟内；

(6) 利用PBS进行多次细胞洗涤，进行拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）。

注意：本实验的成功关键在于细胞悬液的制备和适度的接种密度，务必确保细胞均匀分散，防止细胞团的形成，并谨慎确保接种密度不过于密集。

三、软琼脂克隆形成实验的实验步骤

（1）制备细胞悬液：从正处于对数生长期的细胞中，进行消化后，通过离心将细胞沉淀收集。随后，重悬细胞，进行计数，并可以按需倍比稀释至1×10^3个/mL。

（2）配置琼脂：利用蒸馏水制备两个不同浓度的低熔点琼脂糖溶液，浓度分别为1.2%和0.7%。实验前需高压灭菌，并在40℃水浴中放置以防止凝固。按照1：1的比例混合1.2%琼脂糖和2×DMEM培养基，取1.5 mL加入6孔板中。经冷却凝固后，形成底层琼脂，可将其储存于培养箱中备用。

（3）接种细胞：以1：1的比例混合0.7%琼脂糖和2×DMEM培养基（含20%的胎牛血清）于无菌管中，接着将0.2mL的细胞悬液加入到混合液。充分混匀后，将此混合液加入到带有1.2%琼脂糖底层的孔板中，形成双层琼脂结构，最后，添加一层培养基以防止琼脂干燥，为细胞提供额外的养分，放置于工作台1h左右使其凝固。

（4）待上层琼脂凝固后，将培养皿置于37℃、5% CO2的温箱中培养10～14天。

（5）将培养皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，并计算形成率。

注意事项：

（1）试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃，以确保细胞生长不受影响；

（2）在进行细胞接种时，务必确保细胞悬液充分混匀；

（3）在培养过程中，需关注培养基的颜色，定期更换培养基，并仔细观察是否存在污染迹象；

（4）细胞铺板时密度不能太大，实验过程中速度要快，防止局部结块。

本文作者是"小米"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。

文稿：小米

校对：煲仔饭

素材：Canva

参考资料：

Wang J, Zhang N, Han Q, et al. Pin1 inhibition reverses the acquired resistance of human hepatocellular carcinoma cells to Regorafenib via the Gli1/Snail/E-cadherin pathway. Cancer Lett. 2019;444:82-93. doi:10.1016/j.canlet.2018.12.010

Gan Y, Deng J, Hao Q, et al. UTP11 deficiency suppresses cancer development via nucleolar stress and ferroptosis. Redox Biol. 2023;62:102705. doi:10.1016/j.redox.2023.102705

https://images.app.goo.gl/tQ3y7dRrDU6hqChP9

Gan Y, Deng J, Hao Q, et al. UTP11 deficiency suppresses cancer development via nucleolar stress and ferroptosis. Redox Biol. 2023;62:102705. doi:10.1016/j.redox.2023.102705

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